酶学与酶工程 - 第二章内容

一、酶的分类与命名

酶的分类体系

蛋白类酶(P酶)：国际酶学委员会(EC)提出的六大类酶分类方案
核酸类酶(R酶)：
- 分子内催化R酶(in cis ribozyme)
- 分子间催化R酶(in trans ribozyme)

蛋白类酶(P酶)命名规则

推荐命名法

底物名 + 催化反应类型 + 酶

示例：淀粉酶、蛋白酶(可省略"水解"二字)

可添加来源或特性：胃蛋白酶、碱性磷酸酶

系统命名法

底物名(供体:受体) + 催化反应类型 + 酶

多底物需全部列出(水解反应水可省略)，底物间用":"隔开

需标明底物构型

命名示例

[EC 1.1.1.1] 乙醇脱氢酶

系统命名：乙醇:NAD⁺ 氧化还原酶

反应式：CH₃CH₂OH + NAD⁺ → CH₃CHO + NADH + H⁺

[EC 2.6.1.2] 谷丙转氨酶

系统命名：丙氨酸:α-酮戊二酸氨基转移酶

反应式：丙氨酸 + α-酮戊二酸 → 丙酮酸 + 谷氨酸

P酶系统命名编号

EC 类.亚类.小类.序号

类：六大类酶(氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶)
亚类：按底物、化学键或基团划分
小类：按相同性质划分
序号：具体酶的顺序编号

示例：β-D-葡萄糖氧化还原酶 [EC 1.1.3.4]

类：氧化还原酶类(1)
亚类：在供体CH-OH基上进行(1)
小类：以氧为氢受体(3)
序号：具体酶编号(4)

其他分类方法

按化学组成

简单蛋白酶：活性仅取决于蛋白质结构(如脲酶、蛋白酶)
结合蛋白酶：需非蛋白组分(辅助因子)才有活性

按分子结构

单体酶：单条肽链(溶菌酶)或多肽链共价连接(胰凝乳蛋白酶)
寡聚酶：多个亚基缔合(乳酸脱氢酶)
多酶体系：多种酶嵌合(丙酮酸脱氢酶系)

二、酶的结构与活性中心

酶分子结构层次

一级结构：氨基酸排列顺序
二级结构：α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲
超二级结构：βαβ、βββ、αα等组合体
结构域：独立折叠单位(50-300个氨基酸)
三级结构：多肽链盘曲折叠形成的空间结构
四级结构：多个亚基聚合(如乳酸脱氢酶含4亚基)

酶的活性中心

酶分子中少数氨基酸残基组成的空间区域，负责与底物结合并催化反应

必需基团：直接参与催化的化学基团
结合基团：与底物结合的基团
催化基团：催化化学反应的基团

                    活性中心共性
                    仅占酶分子很小部分(1-2%)
三维实体结构
位于酶表面疏水性裂缝中
构象可变化(诱导契合)
通过次级键(氢键、盐键等)与底物结合

                

活性中心测定方法

切除法

用蛋白水解酶切除肽链，测定剩余活性

化学修饰法

修饰活性中心基团(-OH, -SH等)后测活性变化

X射线晶体衍射

直接测定酶三维结构确定活性中心

基因定点突变

突变特定氨基酸后比较酶活性

三、酶的作用机制

酶催化特性

高度专一性

绝对专一性：只催化一种底物(如脲酶)
构型专一性：识别立体异构体(如L-乳酸脱氢酶)
相对专一性：催化一类相似底物
- 键专一性(如酯酶)
- 基团专一性(如胰蛋白酶)

高效催化

显著降低反应活化能

酶降低活化能示意图

条件温和

最适温度20-40℃，pH 5-8

酶最适条件示意图

活性可调节

酶浓度调节
激素调节
动力学调节
共价修饰
酶原激活

专一性机制学说

锁钥学说

酶与底物如钥匙与锁般精确匹配

局限性：无法解释可逆反应

锁钥模型示意图

诱导契合学说

底物诱导酶构象变化形成互补结构

诱导契合示意图

三点结合理论

酶与底物至少三点结合实现不对称催化

三点结合示意图

高效催化机制

邻近与定向效应

提高活性中心底物浓度和正确取向

应变效应

底物诱导酶构象变化产生张力作用

广义酸碱催化

活性中心酸碱基团参与质子转移

His咪唑基(pKa≈6.0)是重要催化基团

共价催化

酶与底物形成共价中间复合物

Ser羟基、Cys巯基等参与亲核攻击

疏水微环境

低介电环境增强电荷相互作用

四、酶催化反应动力学

米-曼氏方程(Michaelis-Menten)

v = (V_max [S]) / (K_m + [S])

[S] < 0.01K_m：一级反应动力学
[S] > 100K_m：零级反应动力学
0.01K_m < [S] < 100K_m：混合级反应

动力学参数

参数	符号	定义	意义
米氏常数	K_m	v = 1/2 V_max时的底物浓度	酶特征常数，K_m越小亲和力越大
最大反应速率	V_max	酶被底物饱和时的反应速率	反映酶催化效率
催化常数	k_cat	单位时间内每个酶分子转化底物分子数	又称转换数(TN)，值越大效率越高
专一性常数	k_cat/K_m	催化常数与米氏常数比值	表示催化效率，最大值~10⁸-10⁹ s^-1M^-1

动力学参数测定方法

Lineweaver-Burk法

(双倒数作图法)

1/v 对 1/[S]作图得直线

斜率 = K_m/V_max

Y截距 = 1/V_max

X截距 = -1/K_m

双倒数图示意图

Eadie-Hofstee法

v 对 v/[S]作图

斜率 = -K_m

Y截距 = V_max

Hanes-Woolf法

[S]/v 对 [S]作图

斜率 = 1/V_max

Y截距 = K_m/V_max

五、影响酶催化作用的因素

底物浓度

矩形双曲线关系
过量底物可能抑制(底物抑制)
原因：多个底物分子占据部分活性位点

底物浓度影响示意图

酶浓度

当[S]足够高时，v ∝ [E]

酶活力测定时选择[S]=10K_m

酶浓度影响示意图

温度

存在最适温度(optimum temperature)
受作用时间、底物浓度等影响
反应时间长则最适温度低

温度影响示意图

pH值

存在最适pH(optimum pH)
钟罩形曲线关系
影响酶构象和底物解离状态

pH影响示意图

产物

产物抑制(product inhibition)常见

竞争性或非竞争性抑制

激活剂

无机离子(Ca²⁺、Mg²⁺、Cl⁻等)
有机分子
超过阈值可能抑制

抑制剂

降低酶催化速率
研究意义：药物设计、代谢调控

六、酶反应的抑制动力学

抑制类型与鉴别

特征	不可逆抑制	可逆抑制
结合方式	共价结合	非共价结合
去除方法	不能透析去除	可透析去除
时间相关性	与时间有关	与时间无关
酶活性恢复	难以恢复	可恢复

可逆抑制类型

竞争性抑制

抑制剂与底物竞争酶活性中心
K_m增大，V_max不变
示例：磺胺药物抑制二氢叶酸合成酶

竞争性抑制示意图

非竞争性抑制

抑制剂结合非活性中心
K_m不变，V_max降低

非竞争性抑制示意图

反竞争性抑制

抑制剂只结合ES复合物
K_m减小，V_max降低
在多元反应中常见

反竞争性抑制示意图

不可逆抑制类型

非专一性

修饰必需基团和非必需基团
如农药、重金属、烷化剂

专一性

K_s型：结构与底物类似(亲和型)
K_cat型：被酶催化后共价结合(自杀性底物)
示例：青霉素抑制糖肽转肽酶

七、酶的分离纯化

纯化原则与策略

根据使用目的确定纯化策略
经济性：低成本、高效率(3-5步)
保持酶活性：避免高温、剧烈震荡
建立灵敏检测手段评估纯化效果

                    防酶变性措施
                    低温操作(尤其有机溶剂存在时)
避免局部过酸过碱
添加消泡剂防止泡沫
加入EDTA螯合重金属
加入巯基试剂(如DTT)防氧化
加入蛋白酶抑制剂

                

纯化步骤

前处理

材料选择与预处理：选择酶含量高的材料，保持新鲜

细胞破碎

机械法：捣碎、研磨、匀浆
物理法：温度差、压力差、超声波
化学法：有机溶剂、表面活性剂
酶解法：自溶或外加酶制剂

粗分级分离

盐析沉淀(常用硫酸铵)
有机溶剂沉淀(乙醇、丙酮)
等电点沉淀
透析
离心分离

细分级分离

凝胶过滤层析
离子交换层析
亲和层析
电泳分离

层析技术比较

层析类型	分离原理	常用介质	特点
凝胶过滤	分子大小	Sephadex, Superdex	非吸附性，分辨率高
离子交换	电荷性质	DEAE, CM	应用最广泛(75%工艺)
亲和层析	特异性结合	Ni-NTA, Protein A	高效捕获目标分子
疏水层析	疏水性	苯基琼脂糖	分离疏水性蛋白
反相层析	疏水性	C18, C8	用于小分子和变性蛋白

酶活力测定与评价

指标	计算公式	意义
比活力	总活力单位/总蛋白(mg)	酶纯度指标
纯化倍数	纯化后比活力/纯化前比活力	纯化效果
酶活回收率	纯化后总活力/纯化前总活力×100%	得率指标

                    酶活力测定要点
                    测定初速度(底物消耗<5%)
底物浓度远大于酶浓度
在最适条件下进行
迅速混合并计时
采用合适方法中止反应

                