第四章 分子修饰技术与应用
用化学手段将某些原子或化学基团结合到酶分子上，或将酶分子中某基团改变，从而改变酶的催化性质及生理生化性质。
一级结构修饰引起高级结构改变，从而改变酶功能（包括酶活力）。
多点交联形成"刚性"结构
空间障碍"遮盖"活性部位
空间障碍保护敏感键
胰凝乳蛋白酶：用乙醛酸修饰表面氨基，60°C稳定性提高1000倍
SOD酶：PEG修饰后消除抗原性，延长半衰期
| 类型 | 特点 | 方法 |
|---|---|---|
| 基团专一性修饰 | 修饰活性中心特定氨基酸残基 | 专一性化学修饰剂 |
| 位点专一性修饰 | 利用底物类似物亲和标记 | 亲和标记试剂（内生/外生） |
| 差别标记 | 底物保护活性部位后修饰 | 同位素标记 |
将酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，改变酶的特性（专一性、最适pH、稳定性）。
锌型蛋白酶→钙型蛋白酶：酶活力提高20-30%
Fe-SOD→Mn-SOD：H₂O₂稳定性增强
利用小分子化合物对酶侧链基团进行化学修饰，改变酶特性和功能。
| 修饰基团 | 主要氨基酸 | 常用试剂 |
|---|---|---|
| 氨基 | 赖氨酸(Lys) | N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、异硫氰酸酯 |
| 羧基 | Asp, Glu | 羰基二咪唑(CDI)、碳二亚胺(EDC) |
| 巯基 | 半胱氨酸(Cys) | 马来酰亚胺、碘代乙酸 |
| 二硫键 | Cys-Cys | β-单砜、芳氧基马来酰亚胺 |
利用酶分子主链的切断和连接改变酶结构和功能。
天冬氨酸酶：切除10个氨基酸后活力提高4-5倍
ATP酶：切除十几个残基后活力提高5.5倍
改变酶分子中的氨基酸组成，从而改变酶特性。
通过物理因素作用改变酶空间构象，不改变共价键结构。
纤维素酶：高压处理后30-40℃酶活提高10%
胰蛋白酶：盐酸胍变性后50℃重建，稳定性提高5倍
利用蛋白质分子中基团的特殊位置环境
控制不同pH选择性地修饰特定解离状态基团
底物存在时保护活性部位基团
| 性质 | 变化情况 | 原因 |
|---|---|---|
| 热稳定性 | 显著提高 | 刚性结构增强 |
| 抗原性 | 降低或消除 | 抗原决定簇被破坏或遮盖 |
| 对失活因子抵抗力 | 增强 | 空间障碍保护 |
| 体内半衰期 | 延长 | 抗降解能力增强 |
| 最适pH | 可能改变 | 表面电荷分布变化 |
| Km值 | 通常变大 | 空间位阻影响底物结合 |
蛋白质分子设计：基于蛋白质结构-功能关系及分子模型，运用生物信息学、计算生物学和基因工程技术，获得性能更优越的蛋白质。
基本原理：蛋白质一级结构（氨基酸顺序）决定蛋白质高级结构。
一级结构、立体结构、功能结构域及相关同源蛋白质数据
分子模拟（量子力学法、分子力学法、分子动力学法）
评估准确性，分析三维结构特点及活性区域分布
考虑功能要求、氨基酸残基特性、分子间作用力等
多肽化学合成或基因工程表达
结构验证和功能活性检测
多轮设计-修改-实验直至达到目标
设计含突变位点引物，PCR扩增引入变化
含突变碱基引物引导DNA复制
人工合成含突变序列片段取代野生型
| 设计目标 | 解决策略 |
|---|---|
| 热稳定性 | 引入二硫键，增加氢键，改善疏水堆积 |
| 抗氧化稳定性 | Cys→Ala/Ser, Met→Gln/Val/Ile/Leu |
| 改变专一性 | 替换活性部位氨基酸 |
基于同源蛋白质结构预测目标序列结构
解析原子运动轨迹，分析系统随时间变化