酶学与酶工程

传统认识与突破

• 传统认为酶只能在水相中催化，有机溶剂是酶的变性剂
• 1966年：Dostoli和Siegel发现胰凝乳蛋白酶和辣根过氧化物酶在有机溶剂中有催化活性
• 1977年：Klibanov在水/氯仿两相体系中用脂肪酶催化N-乙酰-L-色氨酸酯化，收率100%
• 1984年：Zaks和Klibanov在《Science》发表"酶非水相催化"文章，标志非水酶学诞生

非水酶学定义

研究酶在非水相中催化机理的学科

非水介质中酶催化的优点

• 有利于疏水性底物反应，增强溶解度
• 提高酶的热稳定性
• 催化水中不能进行的反应
• 改变反应平衡移动方向
• 控制底物专一性
• 防止水引起的副反应
• 酶和产物易于回收
• 避免微生物污染

非水酶学中的反应介质

• 有机介质
  • 微水有机溶剂单相体系（水不互溶有机溶剂，含量>98%）
  • 水-有机溶剂单相体系（水与互溶有机助溶剂组成）
  • 水-有机溶剂两相系统（水与疏水性有机溶剂组成）
  • 胶束和反胶束体系（表面活性剂与少量水的有机溶剂系统）
• 气相介质
• 超临界流体介质（如超临界CO₂）
• 离子液介质
• 低共熔混合体系
• 无溶剂或微溶剂反应体系

常用的有机介质体系

非水介质中酶的结构

• 刚-柔并存
  • 刚性：维持生物大分子结构的精确性
  • 柔性：局部区域可运动性
• 水对酶分子空间构象的影响
  • 水分子破坏蛋白质分子内氢键，使结构松散
  • 非水介质中酶分子内氢键增强，结构更紧密
• 动力学刚性与热力学稳定性
  • 动力学刚性：维持酶催化活性必需的构象
  • 热力学稳定性：水导致酶的热失活

非水介质中酶的性质

• 酶的稳定性提高
  • 水减少降低不可逆热失活（如脱氨、肽键水解）
  • 例：脂肪酶Lipozyme TM在橄榄油中60℃保温24小时仍保持82%活性
  • 疏水溶剂对酶基本惰性
  • 蛋白酶解在有机溶剂中不可能发生
• 酶的特异性变化
  • 底物专一性：受溶剂极性影响（疏水性溶剂中疏水性底物易反应）
  • 对映体选择性：水溶液中较强，疏水性有机介质中较差
  • 区域选择性：酶选择性催化底物分子中某个区域基团
  • 键选择性：优先催化特定化学键
• pH记忆
  • 酶在非水介质中保持其冻干前缓冲液的pH状态
  • 可通过有机相缓冲液控制（pH忘记）
• 有机相生物印迹酶
  • 酶与配体相互作用改变构象，在非水介质中保持新构象
  • 例：枯草杆菌蛋白酶在含N-Ac-Tyr-NH₂的缓冲液中冻干后，在辛烷中催化活性提高100倍

必需水

• 定义：维持酶分子完整空间构象所必需的最低水量
• 水的作用
  • 维持酶催化活性必需的构象（润滑剂和增塑剂）
  • 过量水导致酶热失活（脱氨、肽键水解等）
• 水活度（a_w）
  • 定义：a_w = P/P₀（P：体系水蒸气压；P₀：纯水蒸气压）
  • 更准确描述酶活性与水的关系（与溶剂极性无关）
  • 大多数酶催化的最适a_w为0.5-0.6
  • 调控方法：饱和溶液平衡法、高水合盐法、直接加水法
• 最适水含量
  • 酶含水量 < 最适含水量：活性低
  • 酶含水量 > 最适含水量：活性低
  • 水含量微小变化可导致酶催化活力的较大改变

有机溶剂

• 影响途径
  • 干扰酶氢键和疏水键改变构象
  • 与底物或产物相互作用
  • 与酶周围水层作用
• 溶剂极性参数（lgP）
  • lgP = lg(溶剂在正辛烷中浓度/溶剂在水相中浓度)
  • lgP > 4：酶活力低
  • lgP < 2：酶活力较高
  • 2 ≤ lgP ≤ 4：酶活力适中（推荐范围）
• 选择原则
  • 极性系数（lgP在2-5之间）
  • 与反应匹配性（如糖改性需亲水性溶剂）
  • 对主反应惰性
  • 考虑密度、黏度、毒性、成本等

其他因素

• pH选择和离子强度：冻干缓冲液离子强度增大可提高酶活
• 干燥剂、赋形剂：如山梨醇、冠醚可增强酶活性
• 物理因素：微波辐射、超声波等
• 酶形式：酶粉、化学修饰酶、固定化酶

• 合成反应
  • 脂肪酶/酯酶催化有机酸和醇合成酯
  • 蛋白酶催化氨基酸合成多肽
• 转移反应
  • 脂肪酶催化酯与有机酸转酯反应
  • 例：猪胰脂肪酶拆分外消旋体
• 醇解反应
  • 脂肪酶催化酸酐醇解生成二酸单酯
• 氨解反应
  • 脂肪酶催化脂类氨解生成酰胺和醇
  • 例：在叔丁醇中催化外消旋甘氨酸甲酯不对称氨解
• 异构反应
  • 异构酶催化异构化（如消旋酶）
• 氧化还原反应
  • 氧化还原酶催化氧化/还原反应（单加氧、双加氧）
  • 脱氢酶催化醛/酮还原成醇
• 裂合反应
  • 醇腈酶催化醛与氢氰酸生成醇腈衍生物

酯的合成

• 短链脂肪酸酯：香味剂，用于食品、化妆品等
• 糖脂：生物功能分子，酶法选择性酯化解决化学合成难题
• 黄酮类化合物酰化：提高溶解性、稳定性及抗氧化活性
• 生物柴油生产
  • 酶法：脂肪酶催化油脂与小分子醇酯交换
  • 优点：条件温和、无污染；缺点：转化率低（40-60%）、酶寿命短
  • 意义：可再生能源、环保、解决能源安全问题

肽的合成

• 天苯肽：嗜热菌蛋白酶合成（食品甜味剂）
• α-胰蛋白酶：在两相系统中催化合成率100%
• 脂肪酶：催化青霉素前体等多肽合成

高分子的合成与改性

• 旋光性高分子：酶法合成手性聚合物
• 可生物降解高分子
  • 聚酯类：线性单体缩合或内酯开环聚合
  • 聚糖酯类：酶法选择性酰化多糖
• 酚树脂：辣根过氧化物酶（HRP）催化酚类聚合，无甲醛污染
• 导电有机聚合物：HRP催化合成聚苯胺等导电聚合物

光学活性化合物的制备（手性药物拆分）

• 背景：手性药物对映体药理作用不同（如"反应停"事件）
• 拆分原理：脂肪酶选择性催化一种对映体反应
• 应用实例
  • β-阻断剂类（如普萘洛尔、环氧丙醇）
  • 非甾体抗炎剂类（如萘普生、布洛芬）
  • 羟色胺拮抗物和摄取抑制剂