第八章 核酸酶

核酶与脱氧核酶的研究与应用

一、概述

核酶的研究背景

核酶的发现历程

  • 1982年：Cech等发现四膜虫26S rRNA前体具有自我剪接功能
  • 1985年：证明内含子L-19 IVS在体外能高度特异地催化寡聚核糖核苷酸底物的切割和连接
  • 1984年：Altman等发现RNaseP的核酸组分M1 RNA具有催化tRNA前体成熟的活性
  • 1990年：发现以DNA为底物的核酶
  • 1994年：人工合成了脱氧核酶
  • 1997年：Zhang和Cech证明RNA分子具有肽基转移酶活性
Cech和Altman共同获得了1989年度诺贝尔化学奖

核酶发现的意义

  • 改变了"所有酶都是蛋白质"的传统概念
  • 使人们重新审视生物大分子的进化历程
  • 被认为是近十多年生化领域内最令人鼓舞的发现之一

核酶与蛋白质酶的比较

结构比较
  • 蛋白质酶：20多种氨基酸组成，结构复杂
  • 核酶：4种核苷酸组成，结构相对简单
  • 蛋白质酶：小结构即可形成稳定活性中心
  • 核酶：需要较大结构提供稳定活性中心（≥30个核苷酸）
反应机制比较
  • 蛋白质酶：普通酸碱催化（氨基酸参与）
  • 核酶：普通酸碱催化（二价金属离子参与）
  • 蛋白质酶：广泛利用共价催化
  • 核酶：较少利用共价催化
  • 蛋白质酶：利用辅助因子调控反应
  • 核酶：未发现天然核酶利用辅助因子

核酶作用的特点

  • 化学本质：RNA
  • 结构特点：结构简单，有保守的活性中心和与底物互补的侧翼序列
  • 反应特异性：通过互补碱基间的亲和力识别底物
  • 催化效率：比蛋白酶低

核酶的分类

剪接型核酶
  • 既剪又接除去内含子
  • 包括I型IVS和II型IVS
剪切型核酶
  • 只切不接
  • 包括自身催化型和异体催化型

二、剪接型核酶

I类内含子

剪接机制

  • 需要外源鸟苷（或5′鸟苷酸）和Mg²⁺参与
  • 两步磷酸酯键转移反应：
    1. 外源鸟苷的3'羟基攻击5'剪接位点的磷原子
    2. 5'外显子的3'羟基攻击3'剪接位点的磷原子
  • 剪接反应释放出5'端连有外源G的内含子
  • 剪接完成后，许多内含子还会催化自身的环化反应
I类内含子剪接机制示意图

金属离子的作用

  • 特异的构象作用，参与活性部位的化学过程
  • 促进RNA的总体折叠
  • 二价金属离子（如Mg²⁺）与底物活性部位直接相互作用

II类内含子

剪接机制

  • 需要Mg²⁺参加，但不需要鸟苷酸参与
  • 由内含子中腺苷酸(A)的2'羟基攻击5'剪切位点
  • 使5'剪切位点断开，形成"套索"状中间物
  • 然后3'剪切位点断开，两个外显子连接
  • 释放出"套索"状的内含子
II类内含子剪接机制示意图（套索结构）

I类与II类内含子比较

特征 I类内含子 II类内含子
结构 与四膜虫大核rRNA前体IVS相似 与细胞核mRNA前体中的IVS相似
鸟苷需求 需要 不需要
Mg²⁺需求 需要 需要
中间产物 线状内含子 套索状内含子
催化基团 外源鸟苷的3'-OH 内含子腺苷的2'-OH

三、剪切型核酶

自身催化剪切型RNA

锤头结构 (Hammerhead)
  • 呈球状构象，可粗略看成γ形折叠
  • 三个双螺旋区，13个保守核苷酸
  • 剪切反应在GUX序列的3'端发生
  • 目前唯一获得晶体X衍射结构的核酶
  • 切割位点识别遵守NHH规则
  • 催化过程需要二价金属离子参与
锤头结构示意图
发夹结构 (Hairpin)
  • 发现于植物RNA病毒
  • 4个螺旋和2个环
  • 剪切反应发生在底物识别序列GUC的5'端
  • 金属离子在催化中起结构作用
  • 剪切活性比锤头结构核酶高
发夹结构示意图
HDV核酶
  • 与锤头和发夹不同的催化机制
  • 胞嘧啶(C76)充当广义碱
  • 嘧啶环上的N吸引2'羟基上的质子
  • 活化的O亲核攻击相邻的核酸骨架
HDV核酶结构示意图

异体催化剪切型RNA

核糖核酸酶P (RNase P)

  • 内切核酸酶，核糖核蛋白体复合物
  • 剪切所有tRNA前体的5'端，形成3'-OH和5'-磷酸末端
  • 由M1 RNA和蛋白质亚基组成
  • 体外：M1 RNA具催化作用，蛋白质作为辅助因子
  • 体内：M1 RNA和蛋白质对酶活性都是必需的
  • 识别底物的高级结构，而非特定序列

RNase P的催化机制

  • 需要一价金属离子（K⁺或NH₄⁺）
  • 需要二价金属离子（Mg²⁺）
  • 形成2',3'-环磷酸酯
  • 高浓度单价盐和碱性蛋白质稳定RNA结构
  • 二价金属离子活化水分子或络合磷酸的氧原子

影响核酶活性的因素

因素 影响
pH值 pH 7.0-7.5时活性最高
二价金属离子 Mg²⁺、Mn²⁺等能增强活性
抗生素 大多数有抑制效应
变性剂 降低活性
温度 37℃时有适宜活性，65℃范围内随温度升高而增加

四、核酶的应用

在医学领域中的应用

核酶治疗疾病的原理

  • 识别特定位点并结合靶RNA，催化裂解靶RNA
  • 抑制目标基因表达，效率高，专一性强
  • 序列特异性，不编码蛋白而无免疫性
  • 催化结构域小，可作为转基因表达产物或人工合成寡核苷酸
  • 可重复利用，毒性较小
  • 采用多种针对不同RNA靶向序列的核酶，病毒较难产生耐受性

核酶治疗疾病的实例

抗肝炎病毒
  • 针对HAV、HBV、HCV、HDV的研究
  • 多为锤头状结构
  • 中科院上海生化所设计5种锤头型核酶
  • 在细胞内观察到对HBV的抑制
  • 各抗原及病毒颗粒明显减少
抗HIV-1
  • 1998年Wong-Staal等利用发夹核酶
  • 抑制HIV-Ⅰ基因表达
  • 率先进入临床Ⅰ期
抗肿瘤治疗
  • 针对端粒酶RNA组分模板区设计合成锤头状端粒酶核酶(teloRZ)
  • 使HeLa细胞端粒酶活性降至11%-12.5%
  • 细胞生长速度变慢，出现95%凋亡
  • 裸鼠移植瘤端粒酶活性下降69%，抑瘤率达62%

其他应用

  • 防治动植物病毒侵害
  • 马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶构建
  • 马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆

五、脱氧核酶

发展简史

  • 1994年：Gerald F. Joyce等报道人工合成的35bp多聚脱氧核糖核苷酸具有催化功能
  • 1995年：Cuenoud等报道具有连接酶活性的DNA
  • 迄今已发现数十种脱氧核酶
  • 未发现自然界中存在天然的脱氧核酶
  • 对酶的认识产生重大飞跃

催化特征

  • 结合臂的长度影响酶催化转换性
  • RNA-DNA比RNA-RNA稳定性差
  • 对Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺有依赖性
  • 组氨酸、精氨酸促进催化活性
  • 极强的切割特异性（单碱基错配即可大幅降低活性）
  • 裂解位点为嘌呤、嘧啶连接
  • 双链稳定性越高，酶活性越高

催化反应类型

切割DNA

具有自我剪切功能的脱氧核酶

切割RNA

如10-23型脱氧核酶

激酶活性

可以自身磷酸化的DNA分子

连接酶功能

催化连接反应，产生5'-3'磷酸二酯键

金属螯合

催化Cu²⁺或Zn²⁺离子插入到卟啉分子中

目前已筛选到的脱氧核酶

手枪型脱氧核酶
  • Carmi等通过体外筛选技术合成
  • 依赖Ca²⁺
  • 具有自我剪切功能
  • 手枪型二级结构
手枪型脱氧核酶结构
10-23型脱氧核酶
  • Santoro和Joyce通过体外筛选技术提出
  • 通用于RNA切割
  • 催化特性结构域由15个脱氧核苷酸组成
  • 两边连接7~8个脱氧核苷酸构成的底物识别结构域
  • 通过碱基配对与底物结合
  • 切割位点：未配对的嘌呤和配对的嘧啶之间
10-23型脱氧核酶作用机理

SELEX技术及其应用

SELEX技术原理

  • 系统进化配体的指数富集技术
  • 构建单链随机寡核苷酸文库（库容量10¹⁴~10¹⁵）
  • 筛选与靶分子有高亲和力、高特异性结合的配基
  • 是一个定向进化、成熟的过程

筛选过程

建立寡核苷酸文库

DNA文库或RNA文库

文库的筛选

与靶分子相互作用，收集有结合力的分子

文库的扩增

通过PCR或RT-PCR扩增收集的分子

文库表征与效应评价

克隆测序并鉴定

SELEX技术的应用

  • 抗病毒：筛选结合HIV-1反转录酶的适配子
  • 抗炎：筛选抑制p-selectin和L-selectin的适配子
  • 临床应用：Macugen(哌加他尼钠)用于抑制血管内皮生长因子

SELEX技术的优点

  • 体外筛选，特性可依要求改变
  • 克服毒性抗原和免疫原性弱的抗原限制
  • 体外化学合成，保证时间、质量和数量
  • 特异性和亲和力不受非靶蛋白干扰
  • 可连接其他功能基团和分子
  • 分子小，方便体内影像诊断和治疗
  • 变性与复性可逆，可反复使用

核酸酶 - 第八章内容总结

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