酶分子定向进化（进化酶）

酶定向进化概述

天然酶的局限性

酶从生物体内分离后，在人工控制条件下常不能适应环境变化：

稳定性差：易受温度、pH等影响
活性低：催化效率不高
缺乏商业价值催化功能：无法满足特定工业需求

酶分子定向进化概念

模拟自然进化过程（随机变异+自然选择），在体外进行：

人工随机突变

建立突变基因文库

定向选择

特定条件下筛选优良突变体

历史背景

1993年：美国科学家Arnold首次提出酶分子定向进化概念
2018年：Arnold获得诺贝尔化学奖

Frances H. Arnold - 2018年诺贝尔化学奖

酶定向进化发展历史时间线

酶分子定向进化的基本过程

随机突变

产生可遗传的个体差异

定向选择

筛选适应环境的个体

循环累积

反复循环累积优势特性

技术流程图

酶基因获取

提取目标酶基因

随机突变

通过易错PCR、DNA重排等技术引入突变

构建突变基因文库

将突变基因与载体连接

转化/转导

将重组DNA导入宿主细胞

定向筛选

在特定条件下筛选正突变体

进化酶获得

表达并验证优良突变酶

酶定向进化流程图

酶基因体外随机突变技术

主要突变技术

易错PCR

从单一基因出发
改变PCR反应条件
产生碱基配对错误
特点：操作简便，随机突变丰富

DNA改组技术

从同源正突变基因出发
酶切后重新组合
又称DNA重排/洗牌
特点：正突变概率高，进化速度快

交错延伸PCR

混合不同点突变的模板
退火和延伸合并为一步
合成短新生链
交替延伸形成全长基因

随机引物体外重组

单链DNA为模板
随机序列引物PCR
小片段互为模板扩增
优点：模板制备量少，操作简单

基因家族重排

从基因家族同源基因出发
酶切后重新组合
类似DNA改组但出发基因不同

易错PCR技术详解

                    反应条件优化
                    提高Mg²⁺浓度：稳定非互补碱基对
添加Mn²⁺：降低聚合酶特异性
改变4种dNTP浓度比例
使用低保真度DNA聚合酶

                

突变频率控制：每个基因错配碱基2-5个

连续易错PCR

将有益突变基因作为下次PCR模板，连续反复诱变

实例：枯草杆菌蛋白酶在60% DMF中酶活力提高256倍

易错PCR反应示意图

DNA改组技术流程

亲本基因处理

含不同突变类型的亲本基因群

随机切割

DNase I随机切割成片段

片段重组

不加引物PCR循环，片段互为引物和模板

全长基因扩增

加入两端引物常规PCR

获得改组基因库

筛选优良突变体

DNA改组技术示意图

酶基因突变的定向选择

突变基因文库构建

文库包容性

包含基因各种可能突变

足够大的容量

文库完整性

完整反映基因结构和功能

确保表达完整功能酶

载体选择

载体类型	特点	适用场景
质粒载体	自主复制起点，选择性标记	较小DNA片段重组
噬菌体DNA载体	λDNA装载容量大，M13适用单链克隆	大片段DNA克隆
黏粒载体	含λDNA黏端和质粒复制子	高效转导，组装能力强
噬菌粒载体	兼具丝状噬菌体与质粒优点	单链噬菌体包装

基因重组方法

黏性末端连接

同一种限制酶切割
形成黏性末端
T4 DNA连接酶连接
效率高

平头末端连接

平端限制酶切割
T4 DNA连接酶连接
效率较低

修饰末端连接

末端不相匹配时使用
引进附加末端修饰
使末端互相匹配

高通量筛选技术

技术	原理	特点
平板筛选法	依据重组菌表型（生长、颜色、透明圈）	简便、快速、直观
荧光筛选法	荧光报告基因表达情况	灵敏度高，可定量
噬菌体表面展示	外源蛋白展示在噬菌体表面	适合蛋白-配体相互作用
酵母细胞表面展示	外源蛋白展示在酵母细胞表面	适合真核蛋白表达

平板筛选法示例

细胞生长情况

温度梯度筛选热稳定性
抗生素浓度梯度筛选抗性
pH梯度筛选pH稳定性

颜色变化

蓝白斑筛选
磷酸酯酶水解产生黄色产物

透明圈

血纤维蛋白平板
溶栓能力检测

高通量筛选技术示意图